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RP-HPLC法测定佛手饮片中橙皮苷含量

摘要:目的:建立一种可测定佛手饮片中橙皮苷含量的RP-HPLC方法。方法:采用Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱;流动相为甲醇一1.5%磷酸溶液(50:50);检测波长为284nm;流速为1.0mL/min;柱温为40℃;峰面积外标法定量;结果:本法橙皮苷在64.26~963.6μg/mL范围内呈良好的线性关系,(r=0.9998),平均回收率为95.33%,RSD 1.73%。结论:本方法简便、快速、准确可靠,可作为该中药饮片的质控方法。

关键词:佛手;饮片;高效液相色谱法;橙皮苷;含量测定

中图分类号:R285.5文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2007)05-1036-02

佛手为芸香科植物佛手(Citrus medica L var.sarcodacylis Swingle)的干燥果实。为常用中药,味辛、苦、酸,性温,归肝、脾、肺经。具有舒肝理气、和胃止痛的功效,用于肝胃气滞,胸胁胀痛,胃脘痞满,食少呕吐等症。《中国药典》2005年版一部对佛手仅设置了显微鉴别和薄层色谱鉴别,没有含量测定,因橙皮苷为佛手中的主要有效成分,所以笔者采用高效液相色谱法测定其中的橙皮苷含量,结果准确,操作方便,可用于该药的质量控制。经方法学研究,证明本法可行。现报道如下。

1仪器与试药

1.1仪器日本岛津LC-2010 A高效液相色谱仪,自动进样系统;Lcsolution Version 1.11 SP1色谱数据工作站;日本岛津UV-2450紫外分光光度计;KQ-250B型超声波清洗器(功率:250W,频率:40kHz。昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药甲醇为色谱纯;磷酸(分析纯);水为重蒸馏水;橙皮苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:0721-200010(供含量测定用)。佛手饮片(市售批号:041110、050323、050112、050317、050328、050319、050222),均经本所富同义副主任中药师鉴定。

2方法与结果

2.1色谱条件和系统适应性实验 色谱柱:Shim-packVP-ODS(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-1.5%磷酸溶液(50:50);检测波长为284nm;流速:1.0mL/min,柱温:40℃;进样量:5μL;面积外标法定量。理论塔板数按橙皮苷峰计算不应低于4000。分离度大于1.5,对称因子在0.95~1.05之间。

2.2对照品溶液的制备精密称取用五氧化二磷减压干燥24h的橙皮苷对照品10.71mg,置50mL量瓶中,用甲醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取3mL,置10mL量瓶中,加人甲醇稀释至刻度,摇匀,即得每mL含橙皮苷64.26μg的对照品溶液。

2.3供试品溶液制备取佛手饮片适量,60℃烘干,粉碎,过3号筛,精密称取约1.0g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声处理30min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.4标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0,4.0、5.0、8.0、10、15μL,注入高效液相色谱仪,按上述条件测定,记录峰面积,以峰面积(Y)为纵坐标、橙皮苷进样量(X)为横坐标进行线性回归,得回归方程:Y=4.170×102X+1.811×106,r=0.9998。结果表明橙皮苷的溶液在64.26~963.6μg mL之间呈良好的线性关系。

2.5精密度试验按上述色谱条件,取同一批样品溶液(批号:050222),进样5μL,重复进样5次,结果:橙皮苷峰面积基本不变,BSD为0.74%;再取同一批橙皮苷对照品溶液,进样5μL,重复进样5次,结果:橙皮苷峰面积也基本不变,RSD为0.51%,说明仪器性能良好。

2.6重现性试验取同一批号样品6份(批号:050222),照2.3项下操作,分别按上述色谱条件测定,结果RSD为1.94%(n=6)。说明方法重现性良好。

2.7稳定性试验取同一批号样品溶液(批号:050222),在常温下放置12h,每间隔2h测定1次,连续共测定6次,结果:橙皮苷峰面积RSD为1.56%。表明样品溶液的稳定性良好。

2.8回收率试验采用加样回收试验方法,取已知橙皮苷含量(批号:050222,橙皮苷含量为0.4310mg/g)的样品粉末9份,每份约1.0g,精密称定,分别加入一定量对照品(加入量分为3个浓度:低、中、高),照2.3项下操作,分别按上述色谱条件测定。

2.9样品测定取样品适量,照2.3项下操作制备得样品溶液。另取橙皮苷对照品适量,照2.2项下操作制备得对照品溶液。按上述色谱条件进样5μL,记录橙皮苷蜂面积,按外标法计算含量。

3讨论

3.1检测波长的选择取上述橙皮苷对照品溶液,用日本岛津UV-2450紫外分光光度计在波长200-400nm处扫描,结果在284nm波长处有最大吸收,故以284nm为检测波长。

3.2样品的提取笔者曾用甲醇,分别超声提取10、20、30、45、60min后进样测定峰面积比较,结果超声处理30min以后橙皮苷峰面积基本不变,故选用超声处理30min。

3.3柱温的选择柱温虽对组分的分离度影响较小,但对样品组分的保留时间(tR值)影响较大,经反复试验:柱温在40℃时既可加快分析速度,又可保持出峰时间的恒定,从而保证试验结果的重复性和准确性。

3.4流动相的确定笔者比较了甲醇-水(25:75)、乙腈-1.5%磷酸(15:85)、甲醇-1.5%磷酸(50:50)等3种流动相,结果以甲醇-1.5%磷酸(50:50)分离效果最好,故选用此为流动相。然后又对甲醇与不同浓度的磷酸溶液配比对峰形的影响进了考察,实验结果表明随磷酸浓度的增加,峰形进一步变尖锐。但考虑到酸度对色谱柱的影响(要求流动相pH应大于2.0),流动相pH值不宜过低,故选用此比例,此时流动相的pn为2.2左右。

3.5实验补充说明 佛手饮片在空气中容易吸潮,不易粉碎,且影响结果,考虑到佛手含有挥发油等挥发性成分,故样品采用60℃烘干,粉碎,过3号筛(使粉末均匀)等处理。取样及含量计算均以此干燥品为准。另外,不同产地(本文收集到的佛手饮片均标示产地广东)、不同贮藏时间(本文中只收集到2004年和2006年2年的批号,且大部分为2005年)是否对橙皮苷的含量有影响,还有待于进一步考察。

注:本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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作者: 根盆网

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